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发布时间：2024-10-24 09:08
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热心网友
时间：2024-10-24 18:54
引物设计初级篇（一）之原理+注意事项
引物设计是PCR反应中的关键步骤，其好坏直接决定了扩增的效率和特异性，是PCR成功的关键因素。
原理：PCR通过三个热循环过程完成：高温变性使DNA成为单链，中温下引物与单链结合，低温时DNA聚合酶在引物基础上合成互补链。经过多次循环后，可扩增出位于两条引物之间的DN*段。
注意事项：
引物长度：一般在15～30bp，建议18～27bp，避免太短或太长，以平衡特异性和结合力。
GC含量：在40%~60%之间，上下游引物GC含量合Tm值保持接近，以72℃左右为复性最佳条件。
特异性：引物应仅针对目标DN*段设计，确保扩增产物单一。
碱基分布：随机分布，避免聚嘌呤或聚嘧啶，尤其是3‘端不应连续超过3个G或C。
自身互补与互补：引物自身和之间应避免连续4个碱基的互补，以防形成发夹结构或引物二聚体。
5‘端修饰：可对5‘端进行修饰，如引入酶切位点或标记，不影响扩增特异性。
3‘端不可修饰：3‘端为PCR延伸起点，不能有任何修饰，避免形成二级结构。
避免密码子第3位：在编码区域，引物3‘端避免终止于密码子的第3位，以提高扩增特异性和效率。
至此，引物设计的初级篇内容告一段落。接下来，我们将探讨在构建质粒时，选择同源重组还是酶切酶连技术。记得点赞、转发、关注我们哦，您的支持是持续更新的动力！